HLA-A Typing in formalin-fixed paraffin embedded tissue samples : towards potential retrospective analysis

El Antígeno Leucocitario Humano (HLA en inglés) ha sido descrito en muchos casos como factor de pronóstico para cáncer. La característica principal de los genes de HLA, localizados en el cromosoma 6 (6p21.3), son sus numerosos polimorfismos. Los análisis de secuencia de nucleótidos muestran que la v...

Descripción completa

Detalles Bibliográficos
Autor Principal: Leon Rodriguez, Daniel Arturo
Otros Autores: Curtidor, Hernando
Formato: Tesis de maestría (Master Thesis)
Lenguaje:Español (Spanish)
Publicado: Universidad del Rosario 2011
Materias:
Acceso en línea:http://repository.urosario.edu.co/handle/10336/2756
id ir-10336-2756
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institution EdocUR - Universidad del Rosario
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language Español (Spanish)
topic Antígeno Leucocitario Humano. HLA
Cáncer
Antígenos de histocompatibilidad HLA::Diagnostico
Cáncer::Investigaciones
Human Leukocyte Antigen. HLA
Cancer
FFPE
NEOPLASIAS - INVESTIGACIONES - COLOMBIA - ESTADISTICAS
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NEOPLASIAS - INVESTIGACIONES - COLOMBIA - ESTADISTICAS
Leon Rodriguez, Daniel Arturo
HLA-A Typing in formalin-fixed paraffin embedded tissue samples : towards potential retrospective analysis
description El Antígeno Leucocitario Humano (HLA en inglés) ha sido descrito en muchos casos como factor de pronóstico para cáncer. La característica principal de los genes de HLA, localizados en el cromosoma 6 (6p21.3), son sus numerosos polimorfismos. Los análisis de secuencia de nucleótidos muestran que la variación está restringida predominantemente a los exones que codifican los dominios de unión a péptidos de la proteína. Por lo tanto, el polimorfismo del HLA define el repertorio de péptidos que se unen a los alotipos de HLA y este hecho define la habilidad de un individuo para responder a la exposición a muchos agentes infecciosos durante su vida. La tipificación de HLA se ha convertido en un análisis importante en clínica. Muestras de tejido embebidas en parafina y fijadas con formalina (FFPE en inglés) son recolectadas rutinariamente en oncología. Este procedimiento podría ser utilizado como una buena fuente de ADN, dado que en estudios en el pasado los ensayos de recolección de ADN no eran normalmente llevados a cabo de casi ningún tejido o muestra en procedimientos clínicos regulares. Teniendo en cuenta que el problema más importante con el ADN de muestras FFPE es la fragmentación, nosotros propusimos un nuevo método para la tipificación del alelo HLA-A desde muestras FFPE basado en las secuencias del exón 2, 3 y 4. Nosotros diseñamos un juego de 12 cebadores: cuatro para el exón 2 de HLA-A, tres para el exón 3 de HLA-A y cinco para el exón 4 de HLA-A, cada uno de acuerdo las secuencias flanqueantes de su respectivo exón y la variación en la secuencia entre diferentes alelos. 17 muestran FFPE colectadas en el Hospital Universitario de Karolinska en Estocolmo Suecia fueron sometidas a PCR y los productos fueron secuenciados. Finalmente todas las secuencias obtenidas fueron analizadas y comparadas con la base de datos del IMGT-HLA. Las muestras FFPE habían sido previamente tipificadas para HLA y los resultados fueron comparados con los de este método. De acuerdo con nuestros resultados, las muestras pudieron ser correctamente secuenciadas. Con este procedimiento, podemos concluir que nuestro estudio es el primer método de tipificación basado en secuencia que permite analizar muestras viejas de ADN de las cuales no se tiene otra fuente. Este estudio abre la posibilidad de desarrollar análisis para establecer nuevas relaciones entre HLA y diferentes enfermedades como el cáncer también.
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Por lo tanto, el polimorfismo del HLA define el repertorio de péptidos que se unen a los alotipos de HLA y este hecho define la habilidad de un individuo para responder a la exposición a muchos agentes infecciosos durante su vida. La tipificación de HLA se ha convertido en un análisis importante en clínica. Muestras de tejido embebidas en parafina y fijadas con formalina (FFPE en inglés) son recolectadas rutinariamente en oncología. Este procedimiento podría ser utilizado como una buena fuente de ADN, dado que en estudios en el pasado los ensayos de recolección de ADN no eran normalmente llevados a cabo de casi ningún tejido o muestra en procedimientos clínicos regulares. Teniendo en cuenta que el problema más importante con el ADN de muestras FFPE es la fragmentación, nosotros propusimos un nuevo método para la tipificación del alelo HLA-A desde muestras FFPE basado en las secuencias del exón 2, 3 y 4. Nosotros diseñamos un juego de 12 cebadores: cuatro para el exón 2 de HLA-A, tres para el exón 3 de HLA-A y cinco para el exón 4 de HLA-A, cada uno de acuerdo las secuencias flanqueantes de su respectivo exón y la variación en la secuencia entre diferentes alelos. 17 muestran FFPE colectadas en el Hospital Universitario de Karolinska en Estocolmo Suecia fueron sometidas a PCR y los productos fueron secuenciados. Finalmente todas las secuencias obtenidas fueron analizadas y comparadas con la base de datos del IMGT-HLA. Las muestras FFPE habían sido previamente tipificadas para HLA y los resultados fueron comparados con los de este método. De acuerdo con nuestros resultados, las muestras pudieron ser correctamente secuenciadas. Con este procedimiento, podemos concluir que nuestro estudio es el primer método de tipificación basado en secuencia que permite analizar muestras viejas de ADN de las cuales no se tiene otra fuente. Este estudio abre la posibilidad de desarrollar análisis para establecer nuevas relaciones entre HLA y diferentes enfermedades como el cáncer también. Human Leukocyte Antigen (HLA) has been described in many cases as prognostic factor for cancer. The main feature of HLA genes, located on chromosome 6 (6p21.3), is their extensive polymorphism. Nucleotide sequence analysis of alleles shows that the variation is restricted predominantly to exons that encode the peptide-binding domain of the protein. Thus, HLA polymorphism defines the repertoire of peptides that bind to HLA allotypes and this fact defines an individual s ability to respond to exposure to many infections agents throughout his life. HLA typing has become an important analysis in the clinic. Formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissue samples are routinely collected in the oncological clinic. This could be used as a good DNA source, since in past studies DNA collecting assays were not normally performed from almost any kind of tissue or sample on regular clinic procedures. Considering that the most important problem with FFPE DNA is fragmentation, we proposed a new method for HLA-A allele typing from FFPE samples based on the sequences of exons 2, 3 and 4. We designed a set of twelve primers: four for HLA-A exon 2, three for HLA-A exon 3 and five for HLA-A exon 4, each one according to the flanking sequences for their respective exon and the sequence variation between different alleles. 17 FFPE samples collected in Karolinska University Hospital, Stockholm Sweden, and 1 control blood sample underwent amplification reactions and the products were submitted to sequencing. Finally all the obtained sequences were analyzed and compared with IMGT-HLA database. The FFPE samples were previous to this HLA PCR-SSP typed in a certified laboratory and then compared to the results from our novel method. According to this, the samples could be correctly sequenced compared to the previous typing. With this procedure, we conclude that our study is the first Sequence Based Typing method which allows the analysis of damaged DNA samples. It opens the possibility to develop retrospective analysis in order to establish new relationships between HLA and different diseases as well cancer. Erasmus-Columbus 2013 Program 2011-09-02 2012-01-24T19:21:39Z info:eu-repo/semantics/masterThesis info:eu-repo/semantics/acceptedVersion TMM 0005 2011 http://repository.urosario.edu.co/handle/10336/2756 spa http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/co/ info:eu-repo/semantics/openAccess application/pdf Universidad del Rosario Maestría en Ciencias con Énfasis en Genética Humana Facultad de medicina instname:Universidad del Rosario reponame:Repositorio Institucional EdocUR
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